کشت باکتری‌ها

برای شناسایی و تشخیص باکتری‌ها لازم است آن‌ها را در محیط غذایی مناسب کشت دهیم و نظر به اینکه نیازمندی‌های غذایی و شرایط زیستی آن‌ها با یکدیگر متفاوت می‌باشد، یک نوع محیط کشت برای تمام باکتری‌ها مناسب نیست و باید همیشه مواد مورد نیاز آن‌ها را درنظر گرفت. کشت باکتری در موارد زیر ضرور است:

1. چون باکتری‌ها از نظر مرفولوژی (آزمایش میکروسکوپی) قابل تشخیص از یکدیگر نیستند، لذا به منظور به دست آوردن پرگنه خالص باکتری‌ها، اغلب نمونه‌های بالینی را کشت و سپس با آزمایش‌های بیوشیمیایی و سرولوژیکی، باکتری‌ها را به طور دقیق شناسایی می‌نمایند.
2. به منظور درمان بیماری‌های عفونی و تجویز داروی مناسب پس از تعیین هویت عامل بیماری‌زا باید مقاومت و حساسیت آن‌را نسبت به داروهای ضد میکروبی تعیین نمود.
3. در آزمایش‌های سرمی برای تشخیص بیماری‌های عفونی، احتیاج به آنتی‌ژن (Antigen) داریم. به همین دلیل برای تهیۀ آن باید میکروب را کشت داد و از آن آنتی‌ژن تهیه نمود.
4. برای تهیۀ واکسن و سرم از باکتری‌ها نیز ابتدا باید آن‌ها را کشت داد.
5. یکی دیگر از مواد کشت باکتری‌ها، تهیۀ آنتی‌بیوتیک و دیگر فرآورده‌های بیولوژیک است.

برای جلوگیری از آلوده‌شدن محیط کشت با میکروب‌های موجود در هوا باید کشت در کنار شعله و در هود باکتریولوژی و یا در محلی انجام شود که جریان هوا وجود نداشته باشد. میز کار باید عاری از گرد وغبار بوده و هنگام کشت از حرف زدن و تردد خودداری شود.

وسایل مورد نیاز:

الف- ابزار برداشت

در میکروب‌شناسی براساس اینکه برداشت از چه محلی انجام شود از ابزار بخصوص استفاده می‌شود، ازجمله ↓

۱- میلۀ پلاتین (آنس)

میلۀ پلاتین از سه قسمت تشکیل شده است. قسمت انتهایی به‌طول تقریبی ۶٫۵cm از جنس پلاتین که یک‌طرف آن در دستۀ آلومینیومی قرار دارد (روی قسمتی که در دست قرار می‌گیرد، برای جلوگیری از انتقال حرارت از عایق استفاده می‌شود). نظر به بالا بودن قیمت پلاتین، گاه بجای آن از آلیاژهای دیگر مانند نیکروم (Nichrome) استفاده می‌نمایند.
انتهای پلاتین ممکن است به دو صورت باشد:
الف) به‌صورت حلقۀ مدور کاملاً بسته که قطر داخلی آن در حدود ۲-۴ میلی‌متر است.
با این حلقه می‌توان مقداری مواد جامد یا قطره‌ای از مواد مایع را برداشت کرد. نظر به اینکه انتهای سیم به شکل حلقه است به میلۀ پلاتین، لوپ Loop هم گفته می‌شود.
ب) راست و بدون انحناء که از این نوع برای کشت عمقی و برداشت از کلنی‌های مجزا و در مواردی که مقدار کم میکروب مورد نیاز است، استفاده می‌شود.

۲- سواب

سیم یا چوب باریکی است که به انتهای آن پنبه هیدروفیل پیچیده شده است و پس از استریل کردن جهت برداشت، از آن استفاده می‌نمایند. پس از پایان کار انتهای سواب را سوزانده و در ظرف محتوی مادۀ ضد عفونی می‌اندازند.

۳- پی‌پت پاستور

برای برداشت از محیط‌های مایع مورد استفاده قرار می‌دهند. پس از پایان کار باید پی‌پت را در محلول ضد عفونی کننده قرار داد.

ب- محیط کشت

نحوۀ استفاده از محیط‌های کشت مایع و جامد در عناوین زیر درج می‌گردد.

ج- شعله

با توجه به آلودگی‌های احتمالی هنگام برداشت یا کشت، توصیه می‌شود کار در شعاع ۱۰-۱۵ سانتی‌متری شعله انجام شود.

د- گرم‌خانه (انکوباتور یا اتوو)(Incubator, Etuve)

محیط کشت شده را باید در شرایط مناسب از نظر درجۀ حرارت، رطوبت و فشار اکسیژن قرار داد تا رشد خوبی انجام شود. نظر به اینکه درجۀ حرارت مناسب برای باکتری‌های بیماری‌زای انسان ۳۵-۳۸ درجۀ‌سانتی‌گراد است، از دستگاهی به نام گرمخانه یا اتوو که معمولاً بوسیلۀ یک منبع حرارتی، گرم می‌شود، استفاده می‌نمایند. این دستگاه دارای ترموستات جهت تنظیم حرارت می‌باشد که با قطع و وصل کردن جریان برق، درجۀ حرارت را ثابت نگاه می‌دارد. در بعضی موارد لازم است محیط کشت میکروب را در حرارت ۲۲ درجه یا درجات دیگر گرمخانه قرار داد. ضمناً هنگام انکوبشن باید نیازهای اتمسفریک باکتری‌ها را در نظر داشت.

روش‌های کشت

بطور کلی برداشت از محیط مایع، جامد یا بیمار می‌باشد و کشت نیز در محیط مایع یا جامد صورت می‌گیرد.

کشت در محیط جامد داخل لوله

الف- کشت در محیط جامد شیب‌دار (Slant Culture)

کشت در لوله معمولاً زمانی صورت می‌گیرد که نگهداری کشت خالص باکتری مورد نظر باشد، قبل از کشت باید کلیۀ وسایل مورد لزوم را آماده کرد و پنبه را امتحان نمود که به جدار لوله نچسبیده باشد. اگر پنبه به جدار لوله چسبیده بود پنبه را بوسیلۀ انگشت کوچک و کف دست گرفته، لوله را می‌چرخانیم تا پنبه جدا گردد. برای کشت ابتدا میلۀ پلاتین را مانند مداد در دست گرفته و آن را به این طریق استریل می‌نماییم:
قسمت پلاتینی آن را بر روی شعله گرفته تا سرخ شود و سپس دسته فلزی آن را چندبار از روی شعله عبور می‌دهیم. هنگام برداشت از لوله، با سر انگشتان دست چپ، پایین لوله را به طور مایل گرفته، پنبه یا درب لوله را با انگشت کوچک دست راست و کف دست برمی‌داریم. به این ترتیب که انگشت کوچک دست راست را روی کف دست حلقه کرده پنبه را از دهانه لوله بر می‌داریم. (این روش مخصوص افراد راست دست می‌باشد.) پس از برداشتن پنبه باید بلافاصله دهانه لوله را از روی شعله عبور داده تا هوای درون آن گرم و از نفوذ هوای آلوده جلوگیری گردد. آنگاه حلقه پلاتین را که استریل و سرد شده است داخل لوله می‌نماییم. بوسیله حلقه پلاتین کمی از میکروب سطح محیط را برداشته و آن را از لوله خارج می‌کنیم. مجدداً دهانه لوله را از روی شعله عبور داده و پس از آن که پنبه آن را در دهانه لوله گذاشتیم، لوله کشت را در محل خود قرار می‌دهیم. باکتری برداشت شده را بلافاصله در محیط مورد نظر به طریق فوق کشت می‌دهیم. به این منظور مانند روش برداشت عمل نموده و میله پلاتین را که حاوی باکتری است وارد لوله کرده و از یک سانتی‌متری انتهای لوله تا بالا خطوط مارپیچی بر روی تمام سطح ژلوز ترسیم می‌نماییم، به‌طوری که سطح ژلوز کنده نشود. سپس بلافاصله سر لوله را از روش شعله عبور داده و پنبه آن را می‌گذاریم.
هنگامی که حلقه پلاتین آلوده به باکتری است، نباید مستقیماً در شعله قرار گیرد. بلکه باید آن را تدریجاً به شعله چراغ نزدیک کرد و سپس در داخل شعله نگه‌داشت تا سرخ شود. در غیر این صورت مواد آلوده‌ای که هنوز کاملاً استریل نشده‌اند، ممکن است به اطراف پراکنده شود. محیط کشت را در انکوباتور گذاشته و پس از زمان انکوبشن نتیجه را بررسی می‌کنیم.

ب) کشت به روش عمقی در محیط جامد ایستاده و شیب‌دار در لوله

برای کشت در این محیط‌ها میله پلاتین را به صورت نیزه‌ای در آورده، آن‌را به باکتری آغشته می‌کنند. سپس آن را در عمق محیط کشت فرو برده و خارج می‌سازند. و در محیط‌های شیب‌دار پس از خارج نمودن میله از عمق لوله، روی سطح نیز به صورت خطوط مارپیچی کشت خواهد شد.

کشت در محیط مایع

اگر بخواهند در محیط مایع کشت دهند، حلقه پلاتین را استریل و آن را به باکتری آلوده نموده سپس سرپوش لوله را برداشته و پس از حرارت دادن سر لوله، آن را کج کرده، باکتری را به جدار لوله می‌سایند و پس از آن لوله را راست کرده، تا با باکتری‌ها وارد محیط گردند و بعد حلقه پلاتین را می‌سوزانند. اگر نمونه، مایع باشد یک حلقه پر از مایع را برداشته و در محیط مایع جدید وارد می‌کنند.

کشت به روش ایزولشن (جدا کردن باکتری‌ها)

در نمونه‌های جمع‌آوری شده از بیمار، غالباً بیش از یک نوع باکتری وجود دارد. روی این اصل باید آن‌ها را به طریقی کشت داد که پرگنه مجزا به دست آید و با برداشت از پرگنه خالص، خصوصیات حیاتی آن‌ها را مطالعه نمود. برای انجام این روش از پلیت (Plate or Petri dish) استفاده می‌نمایند. (در اینجا نیز ممکن است برداشت از محیط مایع و یا جامد باشد).

برداشت از محیط مایع و جامد

ابتدا حلقه پلاتین را استریل نموده و سپس لوله حاوی محلول باکتری را به آرامی تکان می‌دهند و مطابق روش قبل، سر لوله را حرارت داده و آنگاه لوپ را وارد محیط مایع می‌کنند. دو حلقه از آن برداشت کرده و در یک گوشه از پلیت قرار داده و با حلقه پلاتین و زاویه ۴۵ درجه به صورت خطوط رفت و برگشت و فشرده ۳۰% پلیت نمونه را پخش می‌نمایند. (مرحله A). سپس پلیت را کمی در دست چرخانه و با نوک حلقه پلاتین، خطوطی موازیِ یکدیگر رسم می‌کنند. به‌طوری که تماس این خطوط با خطوط مرحله A به تدریج کم شود. مرحله (B) این عمل را دوبار دیگر تکرار می‌کنند. مراحل (مراحل C و D). لازم به تذکر است که خطوط مرحله آخر (D) با مرحله اول (A) تماس پیدا نکند.
در نتیجه به تدریج تعداد باکتری‌ها در قسمت‌های آخر به قدری کم می‌شود که پس از انکوبشن پرگنه‌های مجزا و مشخص به‌دست می‌آید که پس از برداشت از آن‌ها، می‌توان خصوصیات‌شان را مطالعه نمود. در صورتی که از محیط جامد برداشت کنند به علت اینکه تراکم باکتری بیشتر است بعد از انجام مراحل (A) لوپ را بر روی شعله استریل کرده و پس از سرد شدن مطابق مراحل قبل، کار را ادامه می‌دهند. حلقه پلاتین را پس از استفاده باید مجددا استریل کرده و در جای خود قرار داد.

تهیه گسترش از محیط کشت جامد و رنگ‌آمیزی گرم و بررسی میکروسکوپی

جهت تهیه گسترش ابتدا یک قطره آب بر روی لام قرار داده و سپس با لوپ از باکتری برداشت و با مخلوط کردن با آب سوسپنشنی از باکتری تهیه نموده و آن را در حرارت آزمایشگاه خشک کرده و پس از ثابت کردن به روش گرم رنگ‌آمیزی نموده و بررسی می‌نمایند.